1874 yılında ABD'nin Pennsylvania eyaletinde, Allegheny'de doğdu. Almanya'dan ABD'ye göçmüş Yahudi kökenli bir ailenin çocuğudur. Harvard Üniversitesi'nde kız öğrencilerin gittiği Radcliffe College'da ve Baltimore'daki Johns Hopkins Tıp Okulu'nda öğrenim gördü. 1903 yılında Amerika'yı terk edip Paris'te yaşamaya başladı. Paris'te erkek kardeşiyle birlikte keşfettiği (Cézanne, Matisse, Braque, Juan Gris ve Picasso gibi) yenilikçi ressamların tablolarını almaya başladı ve bu tablolar giderek Avrupa'nın en önemli resim koleksiyonlarından birini oluşturdu.

Bu arada yazın denemelerine girişen Gertrude Stein on dokuzuncu yüzyılın yazın geleneklerini yıkmayı hedefledi. Paris'e yerleşir yerleşmez Quod Erat Demonstrandum adlı kısa bir roman yazdı. Bu roman ancak ölümünden sonra, 1951 yılında Things As They Are (Her Şey Olduğu Gibi) başlığıyla yayımlandı. Gertrude Stein'ın bir yazar olarak tanınmaya başlaması 1909 yılında kendi girişimiyle New York'ta yayımlattığı Three Lives (Üç Yaşam) adlı kitapla gerçekleşti. 1914 yılında yayımlanan ve alışılagelmiş mantık ve dilbilgisi kurallarını tümden yıktığı Tender Buttons (Sevecen Düğmeler) adlı kitabında ise okurları neredeyse şoka uğrattı. 1922 yılında yayımlanan Geography and Plays (Coğrafya ve Oyunlar) ve 1906-1908 yıllarında yazılmasına karşın ancak 1925 yılında yayımlanan bin sayfalık romanı The Making of Americans (Amerikalıların Oluşumu) ile tümüyle çizgidışı ve anlaşılmaz bir yazar olarak ünlenen Stein kitaplarını yayımlatma konusunda hep güçlükle karşılaştı. 1926'da yazma sürecini betimlediği Composition As Explanation'ı (Açıklama Olarak Kompozisyon), 1935'te de Amerika'da verdiği konferansların metinlerini derleyen Lectures in America'yı (Amerika'daki Konuşmalar) yayımladı. 58 yaşında yazdığı Alice B. Toklas'ın Özyaşamöyküsü yine temelde yazarın dil deneyciliğini yansıtsa da, daha önceki yapıtların tersine retrospektif nitelikte, oldukça anlaşılır bir kitaptı. Daha sonra gelen Everybody's Autobiography (Herkesin Özyaşamöyküsü, 1937) ve Wars I Have Seen (Gördüğüm Savaşlar, 1945) adlı kitapları da yaygın bir biçimde kabul gördü. Roman, eleştiri, şiir, oyun vb. türlerde çeşitli yapıtlar veren Gertrude Stein 1946 yılında Paris'te öldü.